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阿尔萨德对:第一代、二代、三代測序技術的基本介紹

發表時間:2017-03-28 01:00來源:網絡

亚冠决赛阿尔萨德 www.dsuyke.com.cn 第一代測序技術-Sanger鏈終止法

一代測序技術是20世紀70年代中期由Fred Sanger及其同事首先發明。其基本原理是,聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區分開來。一代測序實驗的起始材料是均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相同位置上退火,然后該寡聚核苷酸就充當引物來合成與模板互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑(雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團,所以可被用作鏈終止試劑)通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結合后,DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應分四組進行,每一組分別用四種ddNTP(雙脫氧核苷酸)中的一種來進行終止,再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。

第二代測序技術-大規模平行測序

大規模平行測序平臺(massively parallel DNA sequencing platform)的出現不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一,還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測序技術有助于人們以更低廉的價格,更全面、更深入地分析基因組、轉錄組及蛋白質之間交互作用組的各項數據。市面上出現了很多新一代測序儀產品,例如美國Roche Applied Science公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發的Illumina測序儀、美國Applied Biosystems公司的SOLiD測序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上,通過技術創新,用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP,當DNA聚合酶合成互補鏈時,每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光,根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理,從而獲得待測DNA的序列信息。 以Illumina測序儀說明二代測序的一般流程,(1)文庫制備,將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端,緊接著磷酸化并增加一個核苷酸黏性末端。然后將Illumina測序接頭與片段連接。(2)簇的創建,將模板分子加入芯片用于產生克隆簇和測序循環。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內芯片表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構,以供后續的預擴增使用。通過不斷循環獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。(3)測序,分三步:DNA聚合酶結合熒光可逆終止子,熒光標記簇成像,在下一個循環開始前將結合的核苷酸剪切并分解。(4)數據分析

第三代測序技術-高通量、單分子測序

被稱為第三代的測序的He-licos單分子測序儀,PacificBioscience的SMRT技術和
Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的納米孔單分子測序技術正向著高通量 低成本 長讀取長度的方向發展。不同于第二代測序依賴于DNA模板與固體表面相結合然后邊合成邊測序,第三代分子測序,不需要進行PCR擴增。(1)Helico BioScience 單分子測序技術。該測序是基于邊合成邊測序的思想,將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉移酶在 3' 末端加上 poly(A),以及在poly(A)的末端進行熒光標記和阻斷,把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經雜交模板所處的位置,建立邊合成邊測序的位點 加入聚合酶和被Cy3熒光標記脫氧核苷酸進行DNA 合成,每次只加入一種脫氧核苷酸,然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫,直接對Cy3成像,觀測模板位點上是否有熒光信號,然后化學裂解核苷酸上的燃料并釋放 加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物,進行下一輪反應。(2)Pacific BioscienceSMRTT 技術。該測序也是基于邊合成邊測序的原理,這項技于使用了Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級波導)。測序的過程:被熒光標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結合(每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標
記),被激發出熒光,在熒光脈沖結束后,被標記的磷酸集團被切割并釋放,聚合酶轉移到下一個位置,下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖,進行下一個循環。(3)Oxford Nanopore Technologies 的納米孔單分子測序技術。大多數納米孔測序技術的基本原理是當DNA分子或者它的組成堿基從一個孔洞經過時而檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore 測序技術是以α- 溶血素來構建生物納米孔,核酸外切酶依附在孔一側的外表面,一種合成的環糊精做為傳感器共價結合到納米孔的內表面。這個系統被鑲嵌在一個脂雙分子層內,為了提供既符合堿基區分檢測又滿足外切酶活性的物理條件,脂雙分子層兩側為不同的鹽濃度 在適合的電壓下,核酸外切酶消化單鏈 DNA,單個堿基落入孔中,并與孔內的環糊精短暫的相互作用,影響了流過納米孔原本的電流,腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號大小很相近,但胸腺嘧啶在環糊精停留是時間是其他核苷酸的2-3倍,所以每個堿基都因其產生電流干擾振幅是特有的而被區分開來。

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